忧虑康药对动物抑郁行为和血浆cAMP、cGMP的影响及毒性试验研究【文库论文】

【摘要】目的观察忧虑康药（浸膏）对肾阴虚型抑郁模型大鼠行为学和血浆

cAMP、cGMP的影响及毒性试验。方法采用灌胃甲状腺素合并慢性不可预见性

应激制成肾阴虚抑郁动物模型后，随机分为空白对照组、模型组、六味地黄丸

组、氟西汀组、忧虑康低、中、高剂量组，观察各组大鼠敞箱试验和液体消耗

试验等行为学变化，采用放射免疫方法检测血浆cAMP、cGMP含量。并进行急性

毒性试验，计算小鼠最大耐受量。结果肾阴虚抑郁模型大鼠敞箱试验和液体消

耗试验各项指标均显著下降，血浆cAMP含量显著升高；忧虑康药能部分改善大

鼠的抑郁行为，六味地黄丸和忧虑康均能显著降低大鼠血浆cAMP含量。小鼠灌

服忧虑康药1日最大耐受量为360g/kg，相当于人临床用量（1.2g/kg）的300

倍。结论呈量效关系的忧虑康药影响大鼠行为学和调整血浆cAMP、cGMP平衡，

可能正是其滋阴解郁的作用机制之一；该药是安全范围较大的药物，提示用于

临床是安全的。

【关键词】忧虑康；肾阴虚；抑郁症；环腺苷酸；环鸟苷酸；急毒

TheeffectsandtoxicityexperimentalresearchofYouLvKangon

animaldepressionbehaviorandcAMP,cGMPintheplasma

【Abstract】ObjectiveToobjectivetheeffectsofYouLvKang

onthecAMP、cGMPintheplasmaofmodelingratsfollowingrenalyin

deficiencyandonthebehavioroftheseanimalsandtoxicity

test.MethodsRatsweredividedintosevengroupsrandomly:

control,model,LiuWeiDiHuangWan,fiuoxetine,thelow、middleand

high-dosegroupofYouLvKang.Toestablishthemodelingrats

followingrenalyindeficiencybyexposingtheanimalstochronic

stressdepressionandgivingthembyintragastricadminstration.To

observethebehaviorchangsintheopen-fieldtestandfluid

comsumptiontest.theplasmasamplesofexperimentalratsweretaken

forcAMPandcGMPdeterminationbyradioimmunoassay.Tocompute

maximallytolerateddoseofratsbyacutetoxicitytest.ResultsAll

theindexesofthemodelratsintheopen-fieldtestandfluid

comsumptiontestweresignificantlydecreased,theplasma

concentrationofcAMPwassignificantlyelevated;YouLvKangcan

partlyimprovethebehavioroftherats,theplasmaofcAMPwere

significantlydecreasedintheLiuWeiDiHuangWanandYouLvKang

groups.Themaximallytolerateddoseofmousewere360g/kgevery

day,equivaent300timesofclinicdoses（1.2g/kg）.ConclusionOneof

themechanismofincreasingyinandimprovingdepressionwasthe

effectsofTheYouLvKangonthebehaviorchangsoftheratsandon

adjustingthebalancebetweenthecAMPandCGMP.safetymarginofdrug

isbigger,whichsuggestthedrugissafeinclinic.

【Keywords】YouLvKang;renalyin

deficiency;depression;cAMP;cGMP;acutetoxicitytest

抑郁症是一种包括精神症状和躯体症状的复杂的情感性精神障碍，属中医

“郁病”范畴，肾阴虚证是郁病证型之一，由于长期情志不畅，以致耗伤阴精，

髓海不充所致，尤多见于疾病中、后期及老年人群〖1〗。近年来虽然单就抑

郁症以及肝肾阴虚证的研究较多，但将它们联系在一起进行实验室研究却少有

报道。本文通过采用慢性轻度不可预见性的应激模型+甲状腺素的方法，造成大

鼠抑郁阴虚状态，观察临床用于治疗抑郁症有良好疗效的忧虑康药〖2〗对肾

阴虚抑郁模型大鼠行为学及血浆cAMP、cGMP的影响，初步探讨该药滋肾阴抗抑

郁的作用机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物健康SD大鼠，雌雄各半，体重170～190g（购自长沙开福

区东创科技服务部）。昆明小鼠，雌雄各半，体重18～22g（购自湖南中医药

大学实验动物中心，合格证号：20-001）。

1.1.2药物及试剂忧虑康药临床用量为每天80g，按处方称取药材（湖

南中医药大学附属医院提供熟地黄15g，何首乌15g，郁金10g，丹参15g，当

归15g，石斛10g等），水煎2次,过滤，合并滤液,浓缩成相应浓度（浸膏），

4℃保存备用；六味地黄丸（湖南省长沙九芝堂股份有限公司生产，产品批号：

20050219）；盐酸氟西汀胶囊（常州华生制药有限公司，产品批号：

80706001）；甲状腺素片（济南维尔康生化制药有限公司，产品批号：

05055050）；环腺苷酸（cAMP）、环鸟苷酸（cGMP 放免分析试剂盒:上海中医

药大学同位素科，生产批号：061120）。

1.1.3 仪器 敞箱（自制）：由不透明材料制成，底面为100cm×100cm

的正方形，被等分为25 个等边方格，高50cm；放射免疫计数器（GC-1200γ 放

射免疫计数器, 中国科学技术大学科技实业有限公司）；电子天平（型号:ES-

C-600 电子天平,湘仪天平仪器有限公司）；低温大容量高速离心机（型号：

KDC-2046 低温大容量离心机,中国科学技术大学科技实业有限公司）；秒表；

止血钳；恒温烘箱等。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 试验前，进行敞箱试验和液体消耗试验， 根据敞箱试

验和液体消耗试验的结果筛选大鼠，共56 只，随机分为7 组：空白对照组（简

称空白组）、模型对照组（简称模型组）、盐酸氟西汀组（简称氟西汀组）、

六味地黄丸组（简称地黄丸组）、忧虑康液低剂量组（简称ylk 低剂量组）、

忧虑康液中剂量组（简称ylk 中剂量组）、忧虑康液高剂量组（简称ylk 高剂

量组），每组8 只。

1.2.2 肾阴虚抑郁模型的建立及给药 根据文献〖3，4〗 略有改进，采

用灌胃甲状腺素合并慢性轻度不可预见性应激法，建立“肾阴虚抑郁病证”复

合模型。造模方法：将4℃ 冰水游泳5min，禁食禁水24h，夹尾1 min，明暗

颠倒24h，陌生物品（如塑料杯、碎布头等），潮湿垫料、鼠笼倾，40℃高温

环境，电击足底（18V）。共8 种刺激随机安排在21 日中，每日1 种，使大鼠

不能预料刺激发生，以避免产生适应性。同时，每日灌胃甲状腺素2.5mg/

（kg·d），造成大鼠抑郁+肾阴虚状态。 各组从实验第7 日起，氟西汀组给予

盐酸氟西汀3.6mg/kg；地黄丸组给予六味地黄1.6g（生药）/kg； 忧虑康低、

中、高剂量分别给予忧虑康液7.2g（生药）/kg、14.4g（生药）/kg、28.8g

（生药）/kg；空白组与模型组均灌胃等容量蒸馏水。各组灌胃容量均为

10ml/kg，每日1 次，连续给药14 天。除空白组外均单笼饲养。

1.2.3 观察模型动物一般状态及体重变化 实验过程中观察大鼠外表、性

情、活动情况、饮水量、大便情况，每周测1 次体重。

1.2.4 液体消耗试验〖4〗 试验前，在隔噪音、安静的房间内，训练

动物适应含糖饮水，每笼同时放置2 个水瓶，第1 个24h，两瓶均装有1％蔗糖

水，随后的24h，1 个瓶装1％蔗糖水，1 个瓶装纯水。23h 禁食禁水后，进行

动物的基础糖水／纯水消耗试验，同时给予每只大鼠事先定量好的2 瓶水：1

瓶1％蔗糖水，1 瓶纯水。60min 后，取走2 瓶并称重。计算动物的总液体消耗、

糖水消耗、纯水消耗、糖水偏爱（糖水偏爱%=糖水消耗/液体消耗×100％）。

每周进行1 次液体消耗试验。

1.2.5 敞箱试验〖5〗 安静的房间内进行此项试验观察。将大鼠置于

中心方格内，观察大鼠在5min 内中央格停留时间（s）、穿越格数（四爪均进

入的方格方可记数，为水平运动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙

壁，为垂直运动得分）、清洁运动记数、粪便粒数。彻底清洁敞箱后再进行下

1 只大鼠的观察。每只观察1 次。每周进行1 次敞箱试验。

1.2.6 血浆cAMP、cGMP 的测定 实验第22 天，所有动物，断头采血，取

血1～2ml，注入含EDTA·Na2 50μ 1 的试管中，摇匀放入冰浴中，1h 内，4℃

离心2000rpm 离心10min，置于-15℃～-20℃保存，用于测定。测定时严格按

试剂盒说明进行操作。

1.3 急性毒性试验

1.3.1 预试 昆明小鼠6 只，以忧虑康3g 生药/ml 的流浸膏可供灌胃的

最大浓度（3g 生药/ml），小鼠可耐受的最大体积（0.8ml/20g）一次性灌胃给

药，灌胃前禁食不禁水12h，给药后正常饲养，连续观察7 天。实验结果，在

给药当天小鼠活动、精神状态、饮食均正常，一周内未见死亡及其他异常现象，

处死后主要脏器（肝、心、脾、肺、肾） 未发现任何异常改变。因此，无法测

出忧虑康液复方制剂的半数致死量（LD50 ），故改做小鼠最大给药量试验。

1.3.2 MTD（最大耐受量试验）〖6～7〗 取昆明小鼠40 只，按性别与

体重随机分为两组：即对照组和给药组。给药组以忧虑康可供灌胃的最大浓度

（3g 生药/ml）、小鼠可耐受的最大体积（0.8ml/20g），1 日3 次连续灌胃给

药，每次间隔5h，灌胃前禁食不禁水12h；对照组灌胃等容量饮用水。两组小

鼠给药后正常饲养，连续观察7 天。给药前和给药后第4 天、第7 天测小鼠体

重，观察小鼠给药后的反应、饮食、活动情况及动物死亡数。实验结束时，将

全部小鼠处死，解剖，肉眼观察主要脏器的情况，计算小鼠的最大耐受量。

1.4 统计学分析 SPSS 13.0 FOR Windows 统计软件包作为统计工具，计

量资料用（x±s）表示，方差齐者用单因素方差分析，方差不齐的采用Tamhan

分析。

2 结果

2.1 各组大鼠体重及行为学指标的比较

2.1.1 应激前各组大鼠体重及行为学指标的比较 经过筛选分组后，实验

前各组动物的体重、敞箱试验得分和液体消耗试验的各项指标相近，没有统计

学差异（P＞0.05）。见表1。表1 应激前各组大鼠体重及行为学指标的比较

注:P>0.05

2.1.2 治疗前各组大鼠体重及行为学指标的比较 治疗前（应激第7 天）

与空白组相比，各组体重、敞箱试验和液体消耗试验各项指标都有下降。敞箱

试验中，低剂量组水平得分及各组垂直得分均显著下降（P＜0.05）。液体消耗

试验中，各组糖水偏爱%均低于空白组，其中忧虑康低剂量组、高剂量组糖水偏

爱%降低有统计学意义，提示各组动物均出现不同程度的抑郁。见表2。表

2 治疗前各组大鼠体重及行为学指标的比较 注：与空白组比较，*P＜0.05，

**P＜0.01

2.1.3 治疗后各组大鼠体重及行为学指标的比较 治疗14 天（应激第21

天），与空白组比较，模型组体重、敞箱试验和液体消耗试验各项指标差异均

有显著性，提示抑郁模型复制成功；与模型组比较，氟西汀组在各项指标上差

异均有显著性（P＜0.05），忧虑康高剂量水平得分及忧虑康低、中、高剂量组

中央格停留时间显著减少；与氟西汀阳性对照组比较忧虑康各剂量组各指标无

统计学差异，说明忧虑康能部分改善模型动物的抑郁行为。见表3。表3 治疗

14 天各组大鼠体重及行为学指标的比较 注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜

0.01 ；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

2.1.4 忧虑康液对模型动物血浆cAMP、cGMP 的影响 与空白组比较，模

型组血浆cAMP 含量及cAMP/cGMP 比值升高差异有显著性，提示大鼠存在内在的

肾阴虚；与模型组比较，地黄丸组、忧虑康低、中、高剂量组都有下降趋势，

其中地黄丸组、忧虑康中剂量、高剂量组下降有统计学意义（P＜0.05）。见表

4。表4 忧虑康液对肝肾阴虚抑郁模型大鼠血浆 cAMP、cGMP 影响 注：与空白

组比较：*P＜0.05，**P＜0.01 ；与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01

2.2 急性毒性试验 对小鼠灌服忧虑康药进行预试，无法测出忧虑康液的

LD50，提示该中药复方制剂药是安全的；改做最大耐受量试验。灌服忧虑康药

7 天内各小鼠饮食、活动正常，体重增加，毛发光泽，无一例死亡。小鼠灌服

忧虑康药1 日内的最大耐受量为360g/kg，相当于人临床用量（1.2g/kg）的

300 倍。

3 讨论

前期实验〖8〗 证明慢性不可预见性温和应激+甲状腺素是肾阴虚抑郁症

实验研究的动物模型之一，因此本文复制慢性不可预见性温和应激+甲状腺素方

法造模。实验中所采用的敞箱试验得分、糖水消耗量、体重变化是经典的反应

动物抑郁行为学及躯体症状的指标，也是最常用的观察方法。其中体重是反映

机体状况的最直观的指标；液体消耗试验中糖水消耗量、糖水偏爱百分比作为

测量动物模型快感缺乏的有效客观指标，表现了对奖赏的低敏感，模拟了体验

愉快的无能，也反应了内源性抑郁症的中心症状即快感缺失；敞箱试验中的水

平运动得分、垂直运动得分、中央格停留时间和清洁动作次数作为测量动物模

型运动、探索行为能力和兴趣、自我关注能力的客观指标〖9〗 。本实

验可见，模型组与空白组比较，体重、敞箱试验和液体消耗试验各项指标差异

均有显著性，提示抑郁模型复制成功。从敞箱试验来看，与模型组比较，虽然

忧虑康药组差异无显著性，但用药14 天能部分缓解模型动物的抑郁行为，差异

无显著性可能是由于治疗时间较短。忧虑康药与抗抑郁西药盐酸氟西汀，在改

善动物行为及躯体症状方面作用相近；与传统补肾阴药六味地黄丸在改善动物

的一般状态、增加应激抑郁大鼠的体重以及降低其血浆cAMP 含量方面也相近，

显示出其滋补肾阴之功。说明忧虑康药既有一定的抗抑郁作用，也有一定的滋

肾阴作用，且呈量效关系。忧虑康药影响大鼠行为学和调整血浆cAMP、cGMP 含

量平衡，可能正是该方滋阴解郁作用机制之一，其相关研究还有待继续。本研

究结果还证实，忧虑康药是安全范围较大的药物，提示忧虑康药用于临床是安

全的。